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摘要目的：<br>　　 新生儿细菌性脑膜炎是儿科严重感染性疾病之一,临床上尽管可以选用相应的抗生素治疗,但是病死率仍然得不到显著的改善。幸存者常伴有失听、失明、癫痫、智力和运动障碍后遗症。因此,探讨有效的新生儿细菌性脑膜炎的防治策略具有重要意义。<br>　　 大肠杆菌(Escherichia coll,E coli)是导致新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌。从脑膜炎患儿脑脊液中分离的大肠杆菌中,80％以上均带有K1荚膜。现已清楚,E.coli K1通过血行播散入脑而引起脑膜炎。但是,血液中的E.coli K1如何穿过主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)组成的血脑屏障(blood brain barrier,BBB),迄今尚不清楚。借助于体外分离培养的人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)单层--血脑屏障模型,学者们先后鉴定了E.coli K1中的参与侵袭HBMECs相关基因,如fimH,ompA,ibeA,ibeB,CNF1等,并对参与E.coli K1侵袭相关的细胞内信号转导通路如PI3K、PKB、PKC、RhoGTPase以及FAK等细胞骨架组装调控信号分子等进行了探讨。但已鉴定的这些E.coli K1穿过BBB的“决定因子”,特别是每个E.coli K1侵袭基因介导细菌侵袭HBMECs的功能差异、联系、及详细机制尚有待进一步研究。<br>　　 我们在先前的研究中,从致新生儿脑膜炎E.coli K1株RS218(O18:K1:H7)中克隆鉴定了一个E.coli K1毒力岛基因GimA(genetic island of meningitic E.colicontaining ibeA)(图1)。GimA全长20.3kb,仅存在于E.coli K1,其他非脑膜炎大肠杆菌中如E.coli K12均不含GimA序列。GimA含有四个操纵子,编码15个基因:(1)ptnIPKC(GimA1),包括ptnI、ptnP,ptnK、ptnC；(2)CglDTEC(GimA2),包括cglD、cglT、cglE、cglC;(3)GcxKRCI(GimA3),包括gcxK、gcxR、gcxC、gcxI；(4)IbeRAT(GimA4),包括ibeR、ibeA、ibeT。其中,ibeA基因的功能已得到初步研究,它在E.coli K1侵袭HBMECs中起作用；其余14个基因的功能尚不清楚。GimA中推断的各基因编码蛋白与目前GeneBank库中功能已知蛋白之间的同源性高低程度分析结果提示:GimA1中ptnI与磷酸烯醇型丙酮酸磷酸化转移酶有很高的同源性；GimA2中cglD与甘油脱氢酶的同源性为62％；GimA3中gcxC与乙醛酸-醛连接酶的同源性高达67％；GimA4中含有E.coli K1侵袭HBMECs有关的ibeA,而其中的两个基因ibeT和ibeR尚未发现与其他蛋白有较高的同源性,鉴于这两个基因与ibeA同处于一个操纵子,故提示可能参与E.coli K1侵袭HBMECs。探讨这些基因在E.coli K1致脑膜炎中的作用,可以使我们更好的了解大肠杆菌性脑膜炎的发病机制。因此,我们选取了GimA2中的cglD基因和GimA4中的ibeT基因作为研究对象,展开了本工作。<br>　　 图1,E.coli K1 GimA毒力岛基因定位和组成图谱<br>　　 方 法<br>　　 一、大肠杆菌毒力岛基因cglD的功能研究<br>　　 (一)细菌培养<br>　　 大肠杆菌以LB培养基培养,在行细胞侵袭试验前,用含有利福平的BHI培养基培养E44。<br>　　 (二)细胞培养<br>　　 HBMECs于含有10％FBS、10％Nu血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养。<br>　　 (三)E44:△cglD基因缺失突变株的构建<br>　　 将携带打靶基因两侧DNA片段的自杀性质粒pCVD442通过细菌间的接合传递到E44中,利用菌体内同源交换,从E44中剔除cglD基因。<br>　　 (四)互补实验<br>　　 将cglD基因的ORF克隆到质粒pFN476上,将其与pGP1-2共同转化给E44:△cglD。<br>　　 (五)细菌黏附和侵袭试验<br>　　 1、细菌黏附试验<br>　　 向HBMECs单层加入1x107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,收集细胞内外的细菌,结果用相对黏附力表示；<br>　　 2、细菌侵袭试验<br>　　 向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,收集细胞内的细菌,结果用相对侵袭力表示。<br>　　 (六)半数致死量和生存分析<br>　　 Bliss法计算大肠杆菌对新生鼠的半数致死量；Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。<br>　　 (七)新生大鼠实验性细菌性脑膜炎模型的建立<br>　　 皮下注射一定浓度的细菌,建立新生大鼠菌血症模型,脑膜炎模型由血行播散而致。<br>　　 (八)脑脊液白细胞计数及蛋白和乳酸含量的测定<br>　　 血细胞计数板计数脑脊液白细胞,BCA蛋白定量法测定脑脊液蛋白含量,乳酸脱氢酶比色法测定脑脊液乳酸含量。<br>　　 (九)组织病理学分析<br>　　 新生大鼠脑切片经HE染色后,显微镜观察脑膜以及大脑皮层区中性粒细胞的浸润。<br>　　 (十)人多形核白细胞(PMNs)跨内皮迁移实验<br>　　 从人新鲜的外周血中分离PMNs,计数经大肠杆菌趋化后穿过HBMECs单层的PMNs。<br>　　 (十一)重组蛋白的表达和纯化<br>　　 利用BL21(DE3)表达含有cglD基因的重组质粒,用亲和层析法纯化融合蛋白。<br>　　 (十二)甘油脱氢酶活性分析<br>　　 比色法测定菌体裂解液和纯化蛋白的甘油脱氢酶活性。<br>　　 二、大肠杆菌毒力岛基因ibeT的功能研究<br>　　 (一)细菌培养<br>　　 大肠杆菌以LB培养基培养,在行细胞侵袭试验前,用含有利福平的BHI培养基培养E44。<br>　　 (二)细胞培养<br>　　 HBMECs于含有10％FBS、10％Nu血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养。<br>　　 (三)E44:△ibeT基因缺失突变株的构建<br>　　 将携带打靶基因两侧DNA片段的自杀性质粒pCVD442通过细菌间的接合传递到E44中,利用菌体内同源交换,从E44中剔除ibeT基因。<br>　　 (四)互补实验<br>　　 将ibeT基因的ORF克隆到质粒pFN476上,将其与pGP1-2共同转化给E44:ΔibeT。<br>　　 (五)细菌黏附和侵袭试验<br>　　 1、细菌黏附试验<br>　　 向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,收集细胞内外的细菌,结果用相对黏附力表示；<br>　　 2、细菌侵袭试验<br>　　 向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,收集细胞内的细菌,结果用相对侵袭力表示。<br>　　 (六)细菌在细胞内存活试验<br>　　 向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,在继续培养指定时间收集细胞内的细菌,结果用菌落数表示。<br>　　 (七)细菌生长曲线测定<br>　　 将细菌接种于一定体积的培养基中培养,测定大肠杆菌在不同时间点波长为600 nm时的吸光度值,绘制生长曲线。<br>　　 (八)免疫荧光实验<br>　　 激光共聚焦扫描显微镜进行观察。<br>　　 (九)透射电镜观察<br>　　 利用超薄切片机将包埋块切成70～80nm的超薄切片,经染色后,利用透射电子显微镜观察。<br>　　 (十)细菌缓冲容量测定<br>　　 通过测定细菌胞内和胞外总的缓冲容量和细菌胞外缓冲容量,计算得到细菌胞内缓冲容量。<br>　　 结 果<br>　　 一、大肠杆菌毒力岛基因cglD在实验性新生儿脑膜炎中的作用<br>　　 1、E.coli K1等位基因cglD缺失突变株的构建<br>　　 2、cglD基因缺失延长脑膜炎模型鼠的存活时间,但并不影响E.coliK1穿过血脑屏障<br>　　 3、cglD基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑脊液的改变<br>　　 4、cglD基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑膜和脑皮质区中性粒细胞的浸润<br>　　 5、CglD蛋白具有甘油脱氢酶的活性<br>　　 二、毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解<br>　　 1、E.coli K1等位基因ibeT缺失突变株的构建<br>　　 2、E.coli K1 ibeT基因缺失影响E.coli K1侵袭HBMECs<br>　　 3、ibeT基因缺失抑制了E.coli K1在HBMECs中的生长<br>　　 4、ibeT基因缺失导致E.coli K1逃逸HBMECs溶酶体的能力发生缺陷<br>　　 5、ibeT基因有利于E.coli K1从ECV中逃逸入细胞浆<br>　　 6、敲除ibeT基因后的E44:ΔibeT突变株菌体胞内的缓冲容量下降<br>　　 结 论<br>　　 毒力岛基因cglD作为E.coli K1的毒力因子,有利于E.coli K1的体内毒力,参与脑膜炎的炎症反应,但与穿越血脑屏障无关,cglD蛋白具有甘油脱氢酶的活性。<br>　　 毒力岛侵袭基因ibeT有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制。