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摘要鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate,S1P)在细胞的生长、繁殖、移动以及细胞与细胞间的相互作用中发挥重要作用。植物中的研究表明,S1P能够调控气孔的开闭,说明S1P在植物细胞的信号通路中具有重要作用。生物体内S1P的含量是受到鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SPHK)催化的合成反应和鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶(Sphingosine-1-phosphate phosphatase,SPP)或鞘氨醇-1-磷酸裂解酶(Sphingosine-1-phosphate lyase,SPL)催化的降解反应共同调控的。目前,植物中关于参与S1P代谢基因的研究工作报道的很少。本论文的研究主要是在本实验室已有的工作基础之上,以拟南芥AtSPL的T-DNA插入突变体和过量表达株系为材料,通过遗传学的手段,研究AtSPL的生物学功能,探索AtSPL在植物生理过程中的重要作用。<br>　　 外源添加鞘氨醇或其衍生产物的实验结果表明,AtSPL在鞘氨醇或鞘磷脂代谢过程具有重要的作用,AtSPL的缺失可能使得植物体内聚集较多的鞘氨醇或其衍生产物,从而导致对拟南芥种子萌发过程中主根生长的抑制。外源添加神经酰胺的抑制剂FB1的研究结果表明,AtSPL缺失突变体的幼苗对FB1诱导的细胞凋亡现象更敏感,而过量表达株系的幼苗则能减轻FB1诱导的细胞凋亡症状,说明AtSPL在FB1介导的细胞凋亡过程中具有很重要的作用。<br>　　 利用AtSPL的T-DNA突变体和过量表达株系,对AtSPL的生物学功能进行了研究。在含脱落酸(abseisic acid,ABA)的培养基上直接萌发实验表明,突变体和过量表达株系都表现出ABA对主根生长抑制的超敏感表型。移苗实验表明这种抑制主要发生在种子的萌发和早期生长阶段,而对于已经萌发生长3天的幼苗则没有影响。萌发率的统计分析发现,突变体和过量表达株系在含.ABA的培养基上完成萌发的时间比野生型晚2-3天,说明AtSPL在ABA介导的拟南芥种子的萌发过程中有着重要的作用。<br>　　 通过多重PCR的方法,对ABA处理前后,突变体和过量表达株系中与ABA信号相关的基因的表达量进行了研究。ABA合成相关的基因、ABA信号相关的基因以及胁迫相关的基因表达在ABA处理后的突变体和过量表达株系中都有所变化,暗示着在ABA介导的种子的萌发和早期生长过程中,AtSPL直接或间接参与影响了ABA的合成、信号传递等过程。遗传学实验表明,在ABA的信号通路中,AtSPL可能处于较上游的位置,而ABI3、ABI4则处于AtSPL的下游。<br>　　 测定AtSPL突变体和过量表达株系的失水率发现,突变体和过量表达株系的失水率比野生型高约10％,干旱胁迫处理实验也表明,突变体和过量表达株系抗干旱的能力比野生型较差,说明AtSPL可能在调控气孔的开闭、抵御干旱胁迫方面具有一定的作用。<br>　　 对AtSPL蛋白序列进行跨膜结构域的预测,发现AtSPL蛋白含三个可能的跨膜结构域,前两个位于蛋白序列的N端,第三个位于蛋白序列的中间。功能结构域的分析表明,AtSPL含两个保守的功能结构域:吡哆醛依赖的酶结构域和谷氨酸脱羧酶结构域。将去掉AtSPL蛋白N端跨膜结构域后的编码序列在大肠杆菌中进行原核表达与纯化,并以纯化的蛋白进行体外活性实验。结果发现在本实验条件下,AtSPL的重组蛋白没有表现出降解S1P或DHS1P的活性。