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摘要细胞色素b5(Cytochrome b5'Cyt b5)是生物体内一类重要的氧化还原蛋白,由一个血红素b辅基和一条肽链所组成。通过血红素辅基铁离子价态的可逆变化,cyt b5能接受和传递单个电子,实现其传递电子的生理功能。微粒体细胞色素 b5(microsomal or Mc cytochrome b5)是一种结合在膜上的两亲蛋白质。完整形式的细胞色素b5蛋白肽链由大约130个氨基酸残基构成,分子量为16000道儿顿左右。使用蛋白酶消化该蛋白质,可以得到单独的功能性亲水结构域,简称为细胞色素Lb5(lipase-solubilized cytochrome b5)。本文以下提到的细胞色素b5都是指Lb5。细胞色素b5蛋白质分子由两个相对独立的部分组成:一个含有血红素辅基的功能性亲水结构域(Core1),血红素辅基通过His39和His63与蛋白肽链发生相互作用,行使蛋白质的生理功能。其它部分组成了一个是由非极性的氨基酸残基构成的疏水性结构区域(Core2),其对于维持蛋白的整体结构和稳定性具有重要作用。<br>　　 细胞色素b5的溶液和晶体结构表明,Ser64处于血红素疏水腔边缘,血红素辅基b上的7位丙酸根与丝氨基酸形成了两个氢键:7位丙酸根上的羰基氧与Ser64位侧链的羟基氢；丙酸根上的羧酸氢与主链上的氨基氮。Ser64与血红素辅基上的6、7位丙酸根以及Val61、Gly62形成的氢键网络起到了稳定血红素辅基,保持血红素辅基构象的作用。同时Ser64刚好位于第五个α-螺旋结构(Ser64-Phe74)的N端,通过一个由三个氨基酸残基组成的loop环(Val61-Gly62-His63)与第四个α-螺旋(Ala54-Val61)相连,其可能对维持肽链的结构有重要的影响。研究细胞色素b5的稳定性一般包括两部分,即血红素与肽链结合的稳定性和肽链的二级结构的稳定性。其中血红素疏水腔边缘氨基酸残基的极性及所带电荷对蛋白的稳定性有较大影响。定点突变是研究特定氨基酸残基对蛋白结构、功能、性质影响的有力工具。热变性、酸变性和盐酸胍变性是典型的研究蛋白的稳定性,以及折叠与去折叠过程的方法。包含很多稳定性的信息,对蛋白肽链的稳定性具有很强的说明性。紫外可见光谱、圆二色谱和荧光光谱可以提供血红素辅基周围环境,蛋白肽链以及肽链中芳香性氨基酸残基所处微环境受扰动的信息。从结构方面对变性实验得到的稳定性顺序的解释起到辅助作用。<br>　　 本论文,选择了苏氨酸(保守性的氨基酸残基)和三个亲水性氨基酸--赖氨酸、天冬酰胺和组氨酸做为Ser64的取代氨基酸,运用聚合酶链式反应(PCR)方法,构建了一系列S64X突变体蛋白基因。在大肠杆菌系统中表达,通过蛋白质工程方法,分离纯化得到了得到了四个突变体蛋白。野生型和突变体蛋白的纯度和分子量通过聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)和电喷雾质谱(ESI-MS)监测,电泳条带单一清晰,质谱检测的实际分子量与理论分子量符合。确信得到了单一组分的野生型及其突变体蛋白。<br>　　 接着对其进行了紫外可见光谱、圆二色谱等结构信息方面的表征,测定了其氧化还原电位,同时还从热变性、酸变性、盐酸胍变性和血红素转移反应方面对其稳定性进行深入研究。通过对野生型细胞色素b5及其S64X四个突变体的紫外可见光谱,圆二色谱以及氧化还原电位的测定可以观察到,保守性置换的突变蛋白S64T对于蛋白肽链的整体结构,血红素辅基周围微环境以及氧化还原电位的影响都较小；突变体S64K的影响其次；但突变体S64N和S64H却有着较大的影响,且两者的变化相近。<br>　　 野生型细胞色素b5及其S64X突变体蛋白变性实验的研究表明,酸变性由于主要是影响血红素辅基中心铁原子与轴向配体的配位能力,因此突变体蛋白对酸的稳定性相对于野生型变化较小。而热变性和盐酸胍变性由于破坏了蛋白肽链的各种相互作用,而64位引入的氨基酸残基又对蛋白Core1中第五个α-螺旋结构和Core2中的结构影响比较大,因此四个突变体蛋白相对于野生型稳定性都大大降低。顺序为:Cyt b5 S64K<Cyt b5 S64H≈Cyt b5 S64N<Cyt b5 S64T<Cyt b5 WT。其中突变体S64N和S64H的变化几乎一致,S64K的稳定性最差。可能是由于赖氨酸侧链体积表面积较大,柔韧性强,在外加干扰因素增大的时候,其对于肽链结构以及邻近的His63与血红素辅基的配位作用扰动更大。因此其相对于野生型,是四个突变体蛋白中最不稳定的。<br>　　 本论文研究表明:Ser64对于维持Core1的第五个α-螺旋结构有着重要的作用,并有可能影响到Core2的结构,从而使得蛋白的稳定性降低。