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摘要目的:知母作为一种中草药材已被广泛使用了数千年，临床上用于治疗外感热病，燥热烦渴，肠燥便秘等症状。知母皂苷AⅢ(TAⅢ)作为知母中的一种主要药效成分，显示出较好的抗癌、抗糖尿病和抗血栓等的药理活性。本实验室前期研究发现TAⅢ能够导致明显的肝损伤，为了考察其作用机制，同时为了探究其开发为候选药物的潜力，并为知母的临床安全应用提供依据，本课题对TAⅢ的肝损伤作用机制进行了系统研究，同时结合毒代动力学研究初步探讨了TAⅢ毒代和肝毒性（TK/TD）之间的关系。<br>　　方法:1.TAⅢ的肝损伤作用研究。大鼠连续给予TAⅢ(100mg/kg)14天后，观察大鼠体重的变化，同时检测血生化指标和胆汁中8种重要胆酸组分的变化。利用大鼠原代三明治肝细胞模型，考察TAⅢ对肝细胞急性和长期作用后，肝细胞转运胆酸能力的变化。使用Real-Time PCR和Western Blot方法检测TAⅢ对肝细胞中胆酸转运体和代谢酶表达的影响。考察TAⅢ对肝细胞炎症因子释放的影响。使用荧光底物法检测TAⅢ对肝细胞中ROS水平的影响。考察TAⅢ对肝细胞的毒性作用，包括对肝细胞活力、乳酸脱氢酶、ATP和线粒体膜电位的影响。使用激光共聚焦显微镜观察TAⅢ对肝细胞间F-actin完整性的影响。<br>　　2.TAⅢ的毒代动力学研究。使用大鼠原代肝细胞考察TAⅢ的代谢，使用大鼠原代肝细胞和OATPs稳定转染细胞株考察药物转运体对于TAⅢ摄取和胆汁分泌的影响。通过大鼠在体实验，使用液相色谱串联质谱法检测大鼠血浆和肝脏中TAⅢ浓度随时间的变化，利用WinNolin药代动力学软件进行TAⅢ药代参数的计算和分析。使用生理药动学软件(SimCyp)对TAⅢ(50mg/kg)连续给药14天后的在体血药浓度和肝药浓度进行拟合分析。<br>　　结果:TAⅢ连续给药后，大鼠血清中的ALT和总胆酸(TBA)明显上升，检测的8种胆酸成分中有7种胆酸组分含量明显降低。TAⅢ作用于肝细胞2h和24h后，肝细胞对d8-TCA的摄取和胆汁分泌能力明显下降，但是在TAⅢ作用于肝细胞15min时，并无影响。TAⅢ作用于肝细胞24h后肝细胞中胆酸转运体Ntcp、Bsep和Mrp2以及胆酸合成酶Cyp7a1表达下降。TAⅢ并不影响炎症因子TNF-α的释放，但TAⅢ致使肝细胞中ROS的升高，血红素氧合酶1(HO-1)mRNA上调。同时，TAⅢ剂量依赖性的抑制肝细胞的活力，导致肝细胞中ATP、MMP水平的下降和LDH的释放，以及肝细胞间F-actin完整性的破坏。N-乙酰半胱氨酸(NAC)和芒果苷能够减弱TAⅢ导致的肝细胞毒性作用。<br>　　TAⅢ与肝细胞共同孵育后，代谢缓慢。大鼠原代肝细胞能够时间和剂量依赖性的摄取TAⅢ，但是这种摄取并没有温度依赖性;同时OATPs稳转细胞株对TAⅢ的摄取量与Mock组无差异。TAⅢ在三明治肝细胞中胆汁分泌现象不明显，结果显示TAⅢ的肝胆分布不受药物转运体影响。大鼠单次灌胃给予50mg/kgTAⅢ后，在约6h后达到最大药物浓度，Cmax为143.8ng/mL，在36h时TAⅢ的血药浓度仍然有25ng/mL，暗示TAⅢ在体清除较慢（计算半衰期约为20 h）;TAⅢ在肝脏蓄积明显，在血药浓度的达峰时间时，其在肝脏中的浓度为16.5μg/g。<br>　　TAⅢ(50mg/kg)连续给药14天后，其在体拟合出的肝药浓度是血药浓度的5-11倍。<br>　　结论:虽然不是胆酸转运体的抑制剂，但TAⅢ能够引起胆汁淤积型肝损伤，其作用机制与导致的肝细胞中氧化应激的产生有关，破坏了胆酸转运体、代谢酶的表达和功能，影响了肝细胞中胆酸的转运平衡，介导了TAⅢ导致的肝细胞毒性。但这种毒性作用能够被抗氧剂如NAC和芒果苷所减弱，这可能是知母未被发现有肝损伤作用的一个重要原因。TAⅢ在体内清除较慢，不经肝脏代谢，不是肝脏摄取型和外排型转运体的底物。其动物实验表明TAⅢ在肝脏内浓度较高，单独给予测试剂量的TAⅢ有可能引起肝毒性。