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摘要目的:<br>　　越来越多的报道指出肿瘤内存在一小部分具有自我更新能力、多向分化潜能以及更强体内成瘤能力的细胞，称为“肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）”。胶质瘤中肿瘤干细胞的存在也被证实是导致其对化疗不敏感，对放疗抵抗及胶质瘤复发的根源。因此，靶向胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cells，GSCs)的杀伤性治疗已经逐渐成为抗脑胶质瘤治疗的核心。<br>　　内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ(endothelial monocyte activating polypeptideⅡ，EMAPⅡ)是从甲基胆蒽A诱导形成的纤维肉瘤细胞的培养液中发现的，具有多种生物学功能。有报道指出EMAPⅡ在胰腺癌和肺癌中可通过诱导肿瘤血管内皮凋亡和抑制肿瘤血管生成从而能够产生抑制肿瘤生长的作用。我们研究组前期还发现了EMAPⅡ可通过下调紧密连接蛋白从而能够产生开放血肿瘤屏障的作用。但EMAPⅡ能否对胶质瘤细胞产生直接的肿瘤杀伤作用国内外尚未见报道，因此EMAPⅡ对肿瘤细胞的直接杀伤作用仍然是一个崭新的研究方向。<br>　　本研究围绕EMAPⅡ能否对GSCs产生细胞毒性作用以及是否能够诱导GSCs产生细胞周期阻滞来解析EMAPⅡ对GSCs产生的肿瘤杀伤作用。同时分析EMAPⅡ对GSCs产生的肿瘤杀伤作用的机制是否与凋亡或者自噬相关。进一步分析EMAPⅡ诱导GSCs自噬产生及诱导GSCs细胞周期阻滞的相关机制，进而阐明EMAPⅡ对GSCs产生肿瘤杀伤作用的分子机制，证实EMAPⅡ在抗人脑胶质瘤治疗中具有良好的应用前景。<br>　　材料和方法:<br>　　一、实验材料<br>　　（一）实验细胞株<br>　　U87胶质瘤细胞系购自American Type Culture Collection(＜30代)。<br>　　（二）主要试剂<br>　　EMAPⅡ，3-methyladenine（3-MA），胰岛素样生长因子-1(IGF-1)（美国PeproTech公司）;B27，EGF，b-FGF，DMSO（美国Sigma公司）;DMEM高糖培养基（美国HyClone公司）;DMEM/F12/Glutamax和胎牛血清（美国Gibico公司）;细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）;线粒体膜电位检测试剂盒及CCK-8检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）;染色质免疫共沉淀试剂盒（美国Cell Signaling Technology公司）;一抗LC3，p62/SQSTM1，Beclin-1，PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt，FoxO1和Atg2B（美国Abcam公司）;一抗p-FoxO1（美国Cell Signaling Technology公司）;一抗nestin，β-tubulinⅢ，GFAP和CD133（美国Millipore公司）;荧光二抗和一抗GAPDH（美国三塔生物技术有限公司）。<br>　　（三）实验动物<br>　　健康雄性裸鼠，4-6周龄，建立移植瘤模型使用，由中国医科大学附属盛京医院中心实验室购买提供。<br>　　（四）主要仪器<br>　　细胞培养箱（美国Forma scientific公司）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;倒置显微镜（日本TMS公司）;紫外-可见光分光光度计（日本岛津公司）;BD FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司）;超声粉碎机（德国Dr.Hielscher公司）;台式低温超速离心机（德国Sigma公司）。聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（美国Bio-Rad公司）;转印仪（北京市六一仪器厂）;Las3000成像系统（日本FUJIFILM公司);凝胶成像分析软件（江苏捷达科技有限公司）;Real-time PCR仪（美国ABI7500）;电子分析天平（德国Sartorius公司）;-80℃超低温冰箱（日本SANYO公司）;恒温震荡水浴（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）;旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）。<br>　　二、实验方法<br>　　（一）U87MG来源胶质瘤干细胞(GSCs)的分离培养，应用免疫荧光对提取的细胞球表面进行神经干细胞标记物CD133和nestin的检测;同时应用免疫荧光对诱导GSCs多向分化后的细胞进行GFAP和β-tubulinⅢ的检测，证实提取的细胞球细胞具有多向分化潜能。<br>　　（二）CCK-8证实不同浓度EMAPⅡ作用下产生抑制GSCs增殖能力的变化，明确EMAPⅡ的优选浓度，并取该浓度应用于后续试验中。<br>　　（三）应用流式细胞仪双标法检测EMAPⅡ作用下诱导GSCs凋亡的产生。<br>　　（四）应用流式细胞仪检测线粒体膜电位探针JC-1荧光信号强度的变化，解析EMAPⅡ对GSCs线粒体膜电位的影响，明确EMAPⅡ作用下GSCs细胞活力的变化。<br>　　（五）应用流式细胞仪检测EMAPⅡ作用下GSCs细胞周期的改变。<br>　　（六）应用透射电镜观察EMAPⅡ作用下GSCs中自噬小体的产生。<br>　　（七）应用免疫荧光检测EMAPⅡ作用下GSCs中LC3和p62/SQSTM1的表达和分布变化，进一步验证自噬小体的存在。<br>　　（八）应用western blot方法检测自噬标志性分子LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化，同时检测其他自噬相关蛋白p62/SQSTM1、Beclin1及Atg2B的表达变化。<br>　　（九）应用Real time PCR和western blot方法检测EMAPⅡ作用下GSCs中PI3K/Akt/FoxO1信号通路的改变。<br>　　（十）应用western blot方法验证给予IGF-1或小干扰RNA使FoxO1的表达下降后对EMAPⅡ诱导GSCs产生自噬及细胞周期阻滞的影响。<br>　　（十一）应用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法进一步明确EMAPⅡ诱导GSCs产生自噬的机制是否与FoxO1转录调节自噬相关基因蛋白Atg2B的表达相关。<br>　　（十二）建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察EMAPⅡ作用下对GSCs肿瘤生长的抑制作用，同时应用自噬抑制剂3-MA明确自噬在EMAPⅡ产生GSCs肿瘤杀伤作用中所起的作用，解析EMAPⅡ对GSCs产生的肿瘤杀伤作用依赖于EMAPⅡ诱导GSCs产生的自噬性死亡。<br>　　（十三）统计学处理。<br>　　结果:<br>　　1、成功地分离并鉴定了U87MG来源的GSCs。<br>　　2、EMAPⅡ不同浓度0.05 nM、0.5 nM、5nM对GSCs产生细胞增殖的抑制作用差异不明显，低剂量(0.05 nM) EMAPⅡ即可对GSCs产生明显地肿瘤细胞增殖抑制作用，因此选择了低剂量的EMAPⅡ用于后续的研究中。<br>　　3、低剂量EMAPⅡ可明显降低GSCs的细胞活力，在EMAPⅡ作用0.5h时效果最为明显，随着作用时间延长细胞活力逐渐恢复。自噬抑制剂3-MA可显著逆转EMAPⅡ对GSCs降低细胞活力的作用，提示EMAPⅡ对GSCs产生的细胞活力抑制作用与诱导GSCs产生的自噬有关。<br>　　4、低剂量EMAPⅡ作用下GSCs中未检测到凋亡的产生。<br>　　5、低剂量EMAPⅡ可导致GSCs产生细胞周期G2/M期的阻滞，0.5h最为显著，随着作用时间延长细胞周期逐渐恢复。<br>　　6、低剂量EMAPⅡ可诱导GSCs产生自噬，以0.5h最为明显。<br>　　7、低剂量EMAPⅡ作用0.5h和1h可抑制GSCs中PI3K/Akt信号通路，进而可上调FoxO1的表达，促进FoxO1的核转录。<br>　　8、低剂量EMAPⅡ诱导GSCs产生的自噬现象和G2/M期阻滞依赖于PI3K/Akt/FoxO1信号通路。<br>　　9、FoxO1能够结合到Atg2B的启动子区，EMAPⅡ诱导GSCs产生的自噬与脂滴的聚集依赖于FoxO1对Atg2B的转录调节。<br>　　10、低剂量EMAPⅡ可抑制在体GSCs肿瘤的生长，3-MA部分逆转了EMAPⅡ对GSCs肿瘤生长的抑制作用。<br>　　结论:<br>　　1、EMAPⅡ能够在其选择性开放血肿瘤屏障的有效时间内同时产生对GSCs的直接杀伤作用。<br>　　2、EMAPⅡ对GSCs产生肿瘤杀伤作用的机制可能与EMAPⅡ诱导GSCs产生自噬性死亡和G2/M期阻滞相关。<br>　　3、EMAPⅡ可诱导GSCs产生不完全自噬。<br>　　4、EMAPⅡ对GSCs产生肿瘤杀伤作用的分子机制之一可能与EMAPⅡ诱导GSCs产生不完全自噬进而导致蛋白过度蓄积产生的蛋白毒性增加有关。<br>　　5、EMAPⅡ作用下GSCs中大量脂滴的聚集可能是GSCs相对于U87MG特有的一种促存活机制。<br>　　6、EMAPⅡ可诱导GSCs中PI3K/Akt/FoxO1信号通路改变。<br>　　7、EMAPⅡ诱导GSCs产生不完全自噬和G2/M期阻滞可能依赖于PI3K/Akt/FoxO1信号通路。<br>　　8、FoxO1对Atg2B的转录调节可能是EMAPⅡ诱导GSCs产生不完全自噬和脂滴形成的主要分子机制之一。