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摘要异柠檬酸脱氢酶(lsocitrate dehydrogenase，IDH)是一类催化异柠檬酸(ICT)氧化脱羧生成α-酮戊二酸(αKG)的酶家族。根据辅酶的不同，可以分为NADP依赖型(NADP-IDH)和NAD依赖型(NAD-IDH)两大类。在古细菌和绝大多数原核生物中，只存在参与三羧酸循环的NADP-IDH;而在真核生物中，两类IDH共存。其中NADP-IDH存在于线粒体、过氧化物酶体和细胞质中，主要在脂类代谢、抗细胞氧化性损伤方面发挥重要的生物学功能;而NAD-IDH则仅存在于线粒体中，参与三羧酸循环过程。<br>　　哺乳动物NAD-IDH是由α、β和γ三种亚基以2∶1∶1的比例组装成的八聚体酶，可以受到柠檬酸(CIT)和ADP的别构调节，表现为对底物ICT的Km值明显减小，但不影响催化反应的最大速率(Vmax)。α和β亚基、α和γ亚基可以分别形成稳定的二聚体，进而由两种二聚体组装成全酶。然而，虽然αβ和αγ两种异源二聚体的酶学性质在文献中有一些报道，但它们的酶促反应动力学性质、具体生物学功能和结构以及在全酶中的作用和催化反应的分子机制还不清楚。<br>　　在本研究中，我们对人源NAD-IDH(IDH3)的全酶和αβ、αγ两种异源二聚体的功能、结构以及别构调节的分子机制开展了系统研究。研究工作由二部分组成。在第一部分工作中，我们成功地表达和纯化了人源NAD-IDH的全酶和αβ、αγ两种异源二聚体，系统地分析了它们的酶学性质，包括酶的比活力、最适pH、对金属离子的依赖性以及加入调节因子前后的酶动力学参数。研究结果表明，αγ二元复合物具有较高的基础活力，约为全酶的36％，而αβ二元复合物的基础活力极低，仅为全酶的6％。更为重要的是，αγ二元复合物呈现出与全酶一样的酶学和酶促动力学性质，但αβ二元复合物则不具有这些性质。具体来说，在不含有CIT和ADP时，αγ和全酶的最适反应pH值都在6.5左右，而随着CIT和ADP的加入，最适反应pH值都显著升高到7.4，与此同时，两者在非饱和底物浓度下的酶活力也有明显的升高。但是，αβ的最适反应pH值不随CIT和ADP浓度的变化而变化，基本稳定在pH5.9-6.2之间，并且，它在非饱和底物浓度下的活力也没有明显变化。此外，酶促动力学数据显示，在不含CIT和ADP时，αγ对底物ICT、金属离子Mn2+、辅因子NAD的Km值与全酶相似，催化效率是全酶的20％，而αβ对底物和金属离子的Km值比全酶大得多，催化效率仅为全酶的1％。αγ和全酶对底物ICT的Km值(Km, ICT)可以被CIT或ADP分别降低1.7-3倍;当CIT和ADP同时存在时，两者的Km，ICT显著降低15-30倍，而且αγ的催化效率也因此提高到全酶的55％。但是αβ的酶动力学参数则不受CIT或ADP的影响，催化效率没有明显提升。综合这些研究结果表明，在NAD-IDH的全酶中αγ二元复合物主要发挥催化和调控功能，而αβ二元复合物则主要发挥结构功能以帮助全酶的组装。<br>　　在第二部分工作中，我们系统地研究了αγ二元复合物别构调节的分子机制。我们解析了一系列αγ二元复合物结合不同调节因子的复合物的晶体结构，包括结合Mg2+、结合Mg2+-CIT、结合Mg2+-CIT-ADP、结合Ca2+-ICT-ADP、结合Mg2+-MAL-ADP（MAL，丙二酸）等晶体结构，以及αγ突变体(γ-K151A)结合Mg2+-CIT-ADP的结构。通过对这些结构的分析和比对，并结合定点突变和酶动力学分析，鉴定了αγ识别调节因子的关键位点，阐明了不同调节因子之间的相互依赖关系和协同作用方式，并通过氢键网络的分析揭示了人源αγ二元复合物别构调节的分子机制。具体来说，α亚基和γ亚基都是由大结构域、小结构域和钩扣结构域组成，并通过小结构域之间和钩扣结构域之间广泛的亲水和疏水相互作用形成稳定的二聚体。金属离子、CIT和ADP可以结合在γ亚基的别构调节位点的不同部位。金属离子的结合依赖于CIT结合引起的局部构象变化，ADP可以通过金属离子结合所形成的配位键网络来得到稳定。CIT的结合可以显著地改变γ亚基的局部构象，并通过小结构域和钩扣结构域的构象变化，导致α亚基的活性中心发生局部构象变化，稳定了底物ICT的结合，从而达到对α亚基的别构调节，而ADP的结合则可以通过稳定CIT的结合来增强这种效应。作为CIT的同分异构体的ICT也可以结合在CIT位点，引起类似的构象变化，而且也可以被金属离子和ADP所稳定。特别是CIT的结合导致在二聚体相互作用界面上形成两个新的α螺旋结构，它们通过两对氢键与两个亚基的钩扣结构域组成的β片层相连，破坏任何一对氢键作用都会导致αγ二聚体的别构调节功能的丧失。这些研究结果在分子和结构水平上，阐明了αγ二元复合物别构调节的分子机制，不但为进一步研究全酶的催化反应机制和别构调节机制奠定了良好的基础，而且也为真核NAD-IDH在调节机制上的演化分析提供结构证据。