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摘要目的：<br>　　急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，是冠心病的主要死亡原因。尽管许多ACS患者的临床症状各异，但其冠状动脉却具有非常相似的病理生理改变，即冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成。然而，目前尚无有效的生物标志物对其早期诊断与识别。如何应用简单易行的实验方法，对不稳定斑块尤其在斑块破裂前进行早期识别及治疗，将是对ACS甚至动脉粥样硬化性疾病的最具重大意义的研究。<br>　　低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)在内皮下的滞留及其氧化修饰是触发动脉粥样硬化形成的始动环节，继之引起炎症细胞的浸润和激活，并且促进巨噬细胞转化为泡沫细胞。适应性免疫系统可在动脉粥样硬化形成过程中被激活，通过特异性免疫反应不断加重动脉粥样硬化的病理变化过程。由于血中高浓度抗氧化物质的存在，导致循环中的氧化型低密度脂蛋白（oxidativelow density lipoprotein, oxLDL）水平非常低，在健康个体中，估测血浆平均oxLDL浓度仅大约是0.1ng/μg LDL蛋白，直接测定血浆或血清中oxLDL水平有很高难度，并且可能与动脉硬化斑块内oxLDL水平不完全一致。但是，修饰的LDL分子在氧化进程末期具有了趋化性、细胞毒性及免疫原性，能够刺激免疫系统产生针对oxLDL的特异性抗体。这些抗体可在血清中检测到。因此，oxLDL的剂量仅仅反应了某一时刻的氧化状态，可以受到很多因素的影响，而血清中的抗oxLDL抗体的出现表明了体内一个长期脂质过氧化反应的存在。<br>　　目前已经证实，抗oxLDL的自身抗体几乎能够在所有个体中检测到，其往往在临床疾病发生前的早期就达到最高水平。目前已经进行很多研究去确定抗oxLDL自身抗体与心血管疾病的相关性。然而，这些研究的结果并不一致，一些结果表明循环中抗oxLDL自身抗体水平与动脉粥样硬化的严重性呈负相关，然而，也有一些研究则表明相反的结论。对于这些结果的不一致性仍然不能完全解释，可能由于LDL在体外也非常易被氧化修饰，导致在抗体检测方法中很难标准化所使用的LDL抗原，尤其是很多研究测定的是抗原始的LDL的抗体水平。所以，其中一种克服oxLDL抗体检测中标准化问题的方法，就是去测定针对特异性的原始的或MDA-修饰的apoB100肽链序列的自身抗体。<br>　　apoB100的蛋白水解和乙醛修饰的肽类片段是oxLDL的主要抗原成分。这些抗原因为有独特的氨基酸序列所以对oxLDL具有特异性。这些被MHC-Ⅱ呈递的抗原一般为长度为13-17个氨基酸的序列，他们将与其他肽链序列的交叉反应的几率降到最低，具有较好的特异性。成熟的apoB100蛋白是由4563个氨基酸组成的单一多肽链，而抗原表位序列多集中在头端及尾端，已经证实，其N端的1000个氨基酸与八目鳗卵黄生成素中的脂质结合口袋表现出了同源性，在LDL的形成中起到了非常重要的作用，在脂蛋白的形成过程中可以催化脂质向apoB的转移。<br>　　根据以上理论基础，本研究利用生物信息学数据库和在线工具，以中国人ox-LDL蛋白中apoB100的分子特性及表位特征，选择apoB100蛋白N端的1000个氨基酸设计特异性多肽抗原序列，该抗原将覆盖90％以上的中国汉族人主要组织相容复合体(人类MHC或HLA)遗传背景。并应用相似的自行设计、优化的ELISA方法检测血清中的特异性抗体的水平。最终观察外周血中此类抗体与ACS、冠脉斑块稳定型之间的相关性。目前国内外尚未见类似研究。<br>　　方法：<br>　　1、本研究选择中国汉族人群oxLDL蛋白中的apoB100分子，利用生物信息学数据库及软件综合分析蛋白结构和性质，测试其PH值、柔性、亲水性及抗原性等指标，在其N端的1000个氨基酸序列中共设计了4条多肽抗原片段;<br>　　2、利用自行设计并改良的ELISA方法，应用所设计的抗原多肽检测外周血中自身IgG抗体水平，以特异性结合指数(special binding index，SBI)来判定抗原多肽与血清自身抗体的结合程度。SBI=[人多肽抗原OD值-阴性对照OD]/[玉米抗原OD值-阴性对照OD]。<br>　　3、研究对象:所有冠心病、ACS及陈旧性心肌梗死（old myocardial infarction，OMI）患者均来源于2012年1月-2014年1月在中国医科大学附属第四医院心内科住院治疗并确诊的患者，急性心肌梗死诊断标准符合2012版第三次全球心肌梗死通用定义，不稳定心绞痛诊断符合2012年中华医学会心血管病分会颁布的《非ST段抬高急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南》。冠心病及OMI患者诊断标准符合第七版《内科学》诊断。排除患有肿瘤、风湿免疫及结缔组织病、器官移植，长期使用免疫抑制剂者。并取同年于我科体检的未患心血管病人群作为对照组。最终入组冠心病100例，ACS组356例，OMI组100例，分别对应对照组100例、216例及100例。本研究由中国医科大学附属第四医院伦理委员会同意并签署知情同意书。<br>　　4、首先在冠心病患者中验证由上述设计抗原可以检测到外周血IgG抗体的存在，并且与健康对照组之间进行比较。进一步在ACS患者中研究，对比基线资料，观察此类抗体SBI水平在ACS组患者中的变化，并分析各抗体对ACS诊断的敏感性、特异性及诊断阳性预测值。<br>　　5、最后以冠脉病变Gensini评分及冠脉病变累计血管数量情况，分析以上4条抗体水平与冠脉病变的相关性，并进一步在稳定的OMI患者中验证以上抗体水平的变化，以分析以上4条自身IgG抗体水平与冠脉斑块稳定性之间的关系。<br>　　6、统计分析采用非参数检验，所有统计应用统计学软件SPSS18.0(IBM，USA)，P＜0.05视为有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1、线性多肽抗原的设计:根据抗原设计原则，在oxLDL分子的apoB100的前1000个氨基酸序列中，共设计4条多肽片段作为抗原，具体序列分别如下：<br>　　oxLDL-1:H-CDRFKPIRTGISPLALIKGMTRPLSTLIS-OH;<br>　　oxLDL-2:H-LQWLKRVHANPLLIDVVTYLVALIPEPS-OH;<br>　　oxLDL-3:H-TFLDDASPGDKRLAAYLMLMRSPSQA-OH;<br>　　oxLDL-4:H-TVMDFRKFSRNYQLYKSVSLPSLDP-OH<br>　　2、自行设计的改良的ELISA抗体检测方法同样适用于对抗oxLDL IgG抗体的检测，经过对选择的4条oxLDL多肽抗原及玉米抗原进行浓度梯度检测，确定了其工作浓度为10μg/ml。经过反复检测，结果稳定，批间变异率达到质控要求。<br>　　4、在ACS患者中检测上述4条抗原的IgG抗体水平，结果显示:①ACS组中抗oxLDL-1与oxLDL-4的IgG抗体SBI值明显高于对照组。在ACS亚组分析中显示，抗oxLDL-1、oxLDL-4的IgG抗体在AMI及UA组均明显高于对照组;而抗oxLDL-2抗体水平仅UA组升高，明显高于AMI与对照组。OxLDL-3抗体在所有分析中均为阴性。②分析以上4条IgG抗体对ACS、AMI亚组及UA亚组预测的ROC曲线，结果可见，抗oxLDL-1、oxLDL-2及oxLDL-4的IgG抗体均对ACS具有一定的诊断准确性;其中抗oxLDL-1及oxLDL-4的IgG抗体对AMI有一定的诊断准确性。而抗oxLDL-1和oxLDL-2的IgG抗体对UA有一定的诊断准确性。所有抗体在特异性90％左右时的敏感性均偏低。③进一步计算相应IgG抗体的阳性界值，得出抗oxLDL-1、oxLDL-2及oxLDL-4的IgG抗体对ACS诊断的阳性率分别为15.5％、12％及15.4％，联合预测的阳性率达31.6％;抗oxLDL-1及oxLDL-4的IgG抗体对AMI诊断的阳性率分别为15.6％与15.9％，两者联合诊断的阳性率30.6％;抗oxLDL-1与oxLDL-2的IgG抗体对UA诊断的阳性率分别为19.2％与16.7％，两者联合诊断的阳性率为35.9％。<br>　　结论：<br>　　1、利用生物信息学数据库和在线工具，根据中国汉族人oxLDL蛋白中apoB100前1000个氨基酸的结构分析，能够设计出亲水性、抗原性良好的多肽片段作为抗原。并且应用改良的ELISA方法能够检测出外周血中IgG抗体水平，结果稳定。<br>　　2、目前所设计的4条oxLDL多肽抗原中，oxLDL-1、oxLDL-2与oxLDL-4的 IgG抗体水平在ACS组、AMI亚组或UA亚组均有不同程度的升高。ROC曲线分析以上抗体对ACS诊断具有一定的敏感性及特异性，存在明确的阳性预测价值，可能为疾病诊断提供理论依据。<br>　　3、进一步研究证实，4条抗oxLDL的IgG抗体水平与冠脉病变数量、冠脉斑块Gensini评分之间并未见明确相关性，说明斑块负荷的严重程度并未直接影响到此类抗体的变化。<br>　　4、即使在ACS组中明显升高的IgG抗体，在OMI组并未见显著统计学差异。可能进一步说明抗oxLDL的IgG抗体在ACS组的升高更主要来源于斑块的不稳定。为未来对不稳定斑块的早期诊断提供了理论依据。