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摘要糖基转移酶（Glycosyltransferases，GTs）广泛存在于植物中，可以将活化的糖基供体的糖基团转移到受体分子上，改善受体分子的稳定性、水溶性和生物活性，因此在天然产物的生物合成过程中发挥至关重要的作用。<br>　　异槲皮素是一种槲皮素糖苷（槲皮素-3-O-葡萄糖苷），通常被用作抗血栓药物，用来治疗心肌梗塞、大脑缺氧和缺血性疾病。与芦丁和槲皮素相比，异槲皮素在吸收利用度、抗氧化、清除自由基、抗增殖等方面有更好的药理学性能。然而异槲皮素在自然界中的含量很少，目前常用芦丁水解法制备。但自然界中存在着丰富的槲皮素资源，如广泛存在于植物的花、叶、果实中的槲皮素，是天然存在的主要类黄酮化合物。不同的糖基转移酶可催化槲皮素的3、7、3'和4'位羟基糖基化生成相应的单糖苷或双糖苷。本研究中选取了洋葱来源的糖基转移酶UGT73G1以槲皮素为底物催化合成异槲皮素。通过优化表达策略，实现了该酶在原核宿主大肠杆菌中的过量表达;之后对酶进行纯化，研究了重组酶的酶学性质，并通过基因定点突变技术进一步提高了酶活性。在此基础上初步建立了基于糖基转移酶与蔗糖合酶偶联系统的催化体系，比较了UGT73G1突变酶与野生型酶催化合成异槲皮素的效果。<br>　　首先，通过查阅文献以及分析比对不同来源的糖基转移酶序列，选取了洋葱糖基转移酶UGT73G1编码基因，通过分子生物学方法，构建了重组质粒pET28a-UGT1，转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，取粗酶液催化槲皮素，并对其产物进行了鉴定。结果显示，重组酶主要以包涵体的形式存在，粗酶液的比酶活很低，约为0.5U/g; UGT73G1催化合成槲皮素糖苷的种类主要包括槲皮素-3-O-葡萄糖苷（异槲皮素）、槲皮素-3，4'-葡萄糖苷和槲皮素-4'-葡萄糖苷三种，且以合成槲皮素-3-O-葡萄糖苷的活性最高。<br>　　其次，分别采取了同时导入分子伴侣质粒和C端添加组氨酸标签等策略，以提高糖基转移酶UGT73G1在大肠杆菌中的可溶性表达。在C端添加组氨酸标签后，重组蛋白的比酶活约为初始菌株的3倍;在C端组氨酸标签与分子伴侣质粒pG-KJE8双重作用下，重组蛋白的比酶活约为初始菌株的4倍，说明通过C端融合组氨酸标签可有效改善UGT73G1的可溶性表达。对该酶进行纯化，研究了重组酶学相关性质。结果显示，该酶在30℃以下稳定性较好，最适温度为40-45℃;最适pH为7.0，而在pH8.0的条件下稳定性最好;Mg2+和Mn2+对该酶的比酶活有显著的促进作用，Cu2+抑制作用明显。<br>　　再次，为进一步提高UGT73G1的活性，在序列和结构比对分析的基础上，对重组酶进行了定点突变研究。通过同源建模、底物对接、能量优化，选择出两个可能改善酶活的氨基酸残基，设计了三组突变实验:F381Y、V371A、V371G。将三组突变体诱导表达后进行纯化，测定其比酶活，结果显示，突变体V371A的比酶活显著提高，约为野生型酶的2倍。<br>　　最后，构建双基因表达质粒pETDuet-UGT2SUS和pETDuet-UGTv371ASUS,将突变前后的糖基转移酶UGT73G1编码基因与来源予马铃薯的蔗糖合酶基因共表达，建立糖基转移酶与蔗糖合酶偶联的催化体系，利用蔗糖合酶活性催化蔗糖和UDP再生UDPG供给糖基转移反应。研究表明，采用突变酶V371A的反应体系中，异槲皮素的产量提高了约82％，说明该突变酶V371A对于生物催化槲皮素合成异槲皮素有重要的价值。本课题的研究为解决糖基转移酶工业化应用的关键问题提供借鉴。