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摘要L-天冬氨酸氧化酶(L-aspartate oxidase，LASPO，EC1.4.3.16)是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，flavin adenine d inucleotide)为辅因子的黄素氧化酶，从序列同源性上归属于琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶家族。该酶以L-天冬氨酸为底物，生成草酰乙酸，氨气以及过氧化氢。在原核生物体内，该酶是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，nicotinamideadenine dinucleotide)从头合成的第一个酶，可以利用氧气或者延胡索酸作为质子受体，保证菌体在有氧或者无氧条件下的生长。由于L-天冬氨酸氧化酶独有的酶学性质，其在L-氨基酸的定量分析，生物传感器，DL-氨基酸的拆分等方面具有极好的应用潜力。<br>　　本论文将来源于嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的L-天冬氨酸氧化酶基因进行全基因合成，通过分子克隆技术，构建pET-28a-LAO重组质粒，转化BL21(DE3)菌株并进行表达。通过镍亲和层析柱以及离子交换柱进行分离提纯，获得纯度较高的L-天冬氨酸氧化酶。测定含有辅因子FAD的纯酶占酶总量比例为30％，酶活为0.12 U/mg。证明破碎时FAD的添加并不会提高蛋白的可溶表达量，但添加的FAD会牢固的结合在蛋白分子中，使得到的纯酶酶活力可以达到0.6 U/mg。同时测定一系列酶的性质，测定全酶的Km值为1.08mM。在最适pH10，最适温度60℃的条件下达到最大活性为7U/mg。测定了钾盐，钠盐，甘油，咪唑以及PEG对于酶活力测定的影响。通过序列比对，发现保守位点His212可能为底物结合的关键位点，将该位点组氨酸突变为His212G，His212A，His212V，His212F，His212W和His212Y等，发现突变体活力降低，并且Km值升高，同时，证明除了天冬酰胺以外，以上突变体对于其他的18种L-氨基酸并没有活性。以上证据表明该位点的侧链咪唑基团对于L-天冬氨酸的结合具有重要作用，<br>　　后续，针对该酶包涵体表达的问题，进行了包涵体复性条件的初步摸索，测定了不同变性剂，盐浓度，金属离子，氨基酸以及其他亲水化合物对于复性的影响。证明200 mMNaCl或者500 mM KCl的盐离子浓度下，含有400 mM咪唑的变性蛋白浓度低于1 mg/ml的时候透析复性活性高于其他条件。在透析复性后获得了有活性的全酶，复性效率为15％，比酶活为0.16 U/mg。<br>　　本研究实现了L-天冬氨酸氧化酶的表达纯化，并首次实现了复性表达，验证了关键残基对于底物L-天冬氨酸的作用。为解决该类酶在异源表达量低这一困难提供了新的思路和方法，为后续的进一步研究提供了坚实前期基础。