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摘要巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞，参与慢性炎症性疾病的发病过程。根据极化表型的不同，将巨噬细胞分为M1和M2两种极化状态，M1型为经典活化的巨噬细胞，参与急性促炎反应，释放大量促炎因子，调节并促进Th1型免疫反应，具有杀伤病原体和肿瘤细胞作用，但也会导致机体正常组织的炎症反应，这可能构成慢性炎症性疾病的发病基础。M2型为选择性活化的巨噬细胞，调节创伤修复，抑制炎症反应的发生。巨噬细胞表型的可变性和功能多样性是其重要特征，其分化受到各种微环境信号的诱导与调节。细胞内信号转导和转录激活物(STAT)1、核转录因子κB(NF-κB)是促进M1型巨噬细胞极化的关键因子，激活上述两信号通路，参与调控炎症反应的发生发展。巨噬细胞极化的紊乱能反应局部组织微环境的炎症状态，对理解疾病的发生发展具有重要意义。<br>　　由于巨噬细胞具有高度的可塑性，炎症部位M1和M2亚型平衡的改变亦预示着各种炎症过程的扭转以及治疗干预的可能。设计针对巨噬细胞极化的治疗策略，可能成为感染性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤治疗的新靶点。<br>　　贝壳杉烷型二萜类化合物属于唇形科植物蓝萼香茶菜的主要活性成分，研究已发现该化合物具有抗肿瘤和抗炎作用。本研究以人单核细胞株THP-1细胞为靶细胞，采用经典的佛波酯(PMA)诱导的THP-1细胞分化模型，在体外模拟单核细胞向巨噬细胞分化的过程，再给予LPS和IFN-γ刺激，诱导巨噬细胞向M1型分化，在此基础上，探究贝壳杉烷型二萜类化合物PV006对THP-1细胞源性巨噬细胞M1极化信号转导通路关键分子及其下游炎症因子表达的干预作用。<br>　　第一章 建立THP-1源性巨噬细胞M1型极化诱导模式<br>　　目的:确立THP-1细胞体外分化为M1型巨噬细胞的诱导条件，并检测该条件下M1型极化相关的细胞内信号分子通路活化状况及下游细胞因子表达。<br>　　方法:采用PMA刺激THP-1成为巨噬细胞(M0)后，再用不同浓度的LPS+20ng/ml rhIFN-γ诱导或用1000ng/ml LPS+20ng/mlrhIFN-γ诱导不同的时间，促使细胞向M1型极化，并用倒置显微镜观察细胞形态学变化，初步确立诱导条件。利用qRT-PCR法检测M1型极化的THP-1细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8mRNA表达及ELISA法测定IL-8蛋白表达;利用Western Blot法检测M1型极化的THP-1细胞中STAT-1和NF-κB信号通路的活化状况。<br>　　结果:200ng/ml PMA诱导THP-1细胞6h至M0后，再以1000ng/ml LPS+20ng/ml rhIFN-γ继续诱导24h，可见细胞由悬浮状态变为贴壁状态，由圆形转变为长梭形或纺锤形，并伸出若干触角。在上述诱导条件下，M1型极化的THP-1细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8mRNA及IL-8蛋白的表达均发生明显上调。细胞内p-STAT1和NF-κB p-p65表达水平显著升高。<br>　　结论:通过200ng/ml PMA联合1000ng/ml LPS+20ng/ml rhIFN-γ诱导的THP-1细胞发生巨噬细胞M1型极化模式，在细胞形态特征、下游炎性因子基因和蛋白的表达，以及细胞内STAT1和NF-κB信号通路的活化方面均提示这一诱导模式作为体外巨噬细胞M1型极化模拟系统具有可行性。<br>　　第二章 贝壳杉烷型二萜类化合物PV006对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎影响<br>　　目的:建立咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎模型，研究化合物PV006在整体皮肤炎症模型中的治疗效果。<br>　　方法:采用咪喹莫特乳膏连续诱导小鼠背部皮肤，引发出银屑病样皮炎，根据皮损炎症PASI样评分和组织病理HE染色，观察化合物PV006灌胃给药后对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎的实验性治疗作用。<br>　　结果:(1)PV006-100mg/kg组PASI样总分值在d3、d5、d6明显低于同期的溶媒对照组;PV006-12.5mg/kg组PASI样总积分同溶媒对照组相比，差异不大。(2)组织病理检查显示，与溶媒对照组相比，PV006-100mg/kg组表皮部分角化不全并伴部分角化过度，棘层厚度和真皮炎性细胞浸润减轻，Munro微脓肿少见，PV006-12.5mg/kg组在表皮层的改善弱于PV006-100mg/kg组，真皮炎性细胞中等程度浸润。<br>　　结论:综合PASI样评分和组织病理学检查结果，通过灌胃给予PV006-100mg/kg化合物后对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎有一定程度的治疗作用。<br>　　第三章 贝壳杉烷型二萜类化合物PV006对THP-1源性巨噬细胞M1型极化的调节<br>　　目的:通过体外建立的THP-1源性巨噬细胞M1型极化诱导模式，检测化合物PV006对M1型极化的调节作用，为深入探讨该化合物的抗炎作用机制提供实验依据。<br>　　方法:利用MTT法检测化合物PV006对THP-1细胞生长增殖的影响。化合物PV006作用M1极化的THP-1细胞24h后，显微镜下观察细胞形态变化、qRT-PCR法检测IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8mRNA表达、ELISA法检测IL-8蛋白表达以及Western Blot法检测细胞内STAT1和NF-κB通路活化的情况。<br>　　结果:0.78125μg/ml及以下浓度的化合物PV006作用THP-1细胞24h，对细胞生长增殖无明显抑制。不同浓度PV006干预24小时可在镜下观察到巨噬细胞作M1极化处理后未表现出M1型极化细胞明显的长梭形或纺锤形，大部分细胞仍表现为圆形。化合物PV006可不同程度地下调M1极化时优势表达的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8mRNA及IL-8蛋白水平，并呈剂量依赖趋势，细胞内p-STAT1和NF-κBp-p65表达降低。<br>　　结论:贝壳杉烷型二萜类化合物PV006通过影响细胞形态改变、下调炎性因子基因、蛋白表达以及抑制细胞内STAT-1Tyr701位点和NF-κB p65Ser536位点磷酸化，发挥抑制巨噬细胞向M1型分化的作用，这可能是该化合物发挥抗炎作用的机理之一。