检索历史 清除

摘要吸血水蛭用于医疗研究已经超过了两千多年。刘伟慧通从森林山蛭中发现一条对凝血因子XⅡa（FXⅡa，抑制常数298nm）和胰蛋白酶抑制活性的多肽(sylvestin)。此多肽的成熟肽段是由43个氨基酸构成，属于Kazal家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Proteinase Inhibitor,SPI）。本研究通过构建大肠杆菌PET-32a表达系统，获得具有肠激酶切割位点的r-sylvestin融合蛋白，然后利用镍离子柱亲和层析纯化融合蛋白，使用肠激酶切割融合蛋白，最后通过反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)分离纯化，得到了具有FXⅡa酶抑制活性和PK酶抑制活性的蛋白。利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MAIDI-TOF-MS)测定纯化后重组r-sylvestin(4790Da)蛋白分子量，得率为3％，纯度大于95％。R-sylvestin具有6个半胱氨酸，形成三对二硫键，使r-sylvestin在血液中具有很高的稳定性。经检测，r-sylvestin的血浆半衰期为4.6h。还初步探究了r-sylvestin临床用药的安全性，结果表明，r-sylvestin不具有溶血活性和细胞毒性，并且出血活性较低，用药安全性较高。<br>　　因子XⅡa(FXⅡa)和血浆前激肽释放酶(PPK)在缺血性脑卒中(IS)的血栓性炎症病理生理学中起中心作用。FXⅡa分别通过驱动内源性凝血途径和激肽释放酶一激肽系统激活促凝血和促炎过程。此外，FXⅡa切割PPK以产生活性血浆激肽释放酶(PK)，且激活的PK可通过激肽释放酶介导的激肽原进一步释放爽性介质缓激肽。PK可以相互激活FXⅡ，导致接触激活系统的自动活化，通过内在途径形成血栓。PK也参与了脑水肿和血脑屏障(BBB)损伤，这是IS的核心机制。因此，接触激活系统的功能性抑制可能是治疗IS中的血栓形成和炎症的有希望的方法。最近的研究表明，阻断FXⅡ或PK是通过抵抗脑内血栓形成和炎症来改善缺血性脑中神经元存活的有效策略。重要的是，尽管它们对血栓形成和炎症很重要，但FXⅡ或PK的基因缺失或药理学抑制与任何出血性疾病无关。<br>　　在我们的研究中，从森林山蛭中发现的这种接触激活系统抑制剂，预期具有对永久性及短时性脑缺血性脑卒中疾病具有保护作用。实验证明，r-sylvestin能通过降低血栓的发生和血脑屏障的损伤，从而降低小鼠缺血性脑脑卒中疾病发生的程度，不具有出血活性。并且在小鼠永久性脑缺血模型中，4mg/kg r-sylvestin的作用剂量能显著降低小鼠的死亡率。在第七天时，4mg/kg r-sylvestin组小鼠存活率为80％，而模型对照组的小鼠存活率仅40％。<br>　　这些结果表明，r-sylvestin具有成为一种新型的预防治疗缺血性脑卒中疾病的潜力药物，具有药物作用效果明显，出血活性低，适合工业化生产等优点。