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摘要第一部分:21-羟化酶缺陷症患者CYP21A2基因突变谱和拷贝数变异的研究<br>　　背景<br>　　21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)是先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)最常见的类型，为常染色体隐性遗传病，占全部CAH的90％-95％。21-OHD主要是由于皮质醇合成过程中必需的21-羟化酶缺陷，导致17α-羟孕酮和孕酮向11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮的转化受阻，引起皮质醇和醛固酮的合成不足所致。21-OHD患者的确诊，主要依据临床表现、生化和激素水平检测及基因检测。CYP21A2基因编码21-羟化酶，其与假基因CYP21A1P高度同源且串联排列于第6号染色体短臂(6p21.3)，因此，基因转换和重排成为21-OHD的主要基因突变来源。PCR扩增联合Sanger测序是检测CYP21A2基因点突变、小的插入或缺失(＜50bp)的主要方法，多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)主要用来检测CYP21A2基因拷贝数变异(copy number variation，CNV)。CYP21A2基因的拷贝数变异包括正常2拷贝、拷贝缺失及拷贝重复，根据基因缺失长度的不同，拷贝缺失又分为CYP21A2基因完全缺失和不同形式的CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因，已报道的CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因类型共9种，即嵌合基因CH-1至CH-9型。到目前为止，国内尚无对于CYP21A2基因拷贝数变异及CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因类型大样本研究报道。<br>　　目的<br>　　本研究旨在探究中国大样本21-OHD患者的CYP21A2基因突变谱，包括常见或罕见的点突变、小的插入缺失突变以及拷贝数变异，并进一步分析CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因分型的情况及各种类型所占比例。<br>　　方法<br>　　纳入2015年1月至2019年7月在北京协和医院内分泌科就诊的21-OHD患者500例，收集患者的一般临床资料。提取患者外周血白细胞DNA，利用PCR扩增联合Sanger测序及MLPA技术，分别检测患者CYP21A2基因点突变及拷贝数变异，利用软件预测首次发现的罕见突变位点的致病性及突变蛋白质结构，并探究CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因类型及所占比例。<br>　　结果<br>　　(1)本研究检出CYP21A2基因点突变及小的插入或缺失突变共43种。其中15种为首次发现的罕见变异，文献报道的10种最常见CYP21A2基因突变的发生率为92.9％，发生频率最高的3种突变为CYP21A2大片段缺失或重排、内含子i2g突变及I173N，占全部突变类型的68.3％;<br>　　(2)本研究首次发现的15种罕见基因突变位点包括:L30P，R92G，L100P，A119D,Q145R,A153P,F165S,L199*,D259V,P361L,A363T,D378V,c.1348_1349insA，P460L和G492R，其中13种错义突变均经软件预测为致病突变，氨基酸改变破坏了蛋白质空间结构;<br>　　(3)CYP21A2基因拷贝数变异广泛存在于21-OHD患者中，35.6％的患者携带拷贝数变异，包括CYP21A2基因单拷贝缺失、双拷贝缺失和3拷贝重复。CYP21A2基因双拷贝缺失患者3例，3拷贝重复的患者2例。单拷贝缺失又包括CYP21A2基因大片段缺失(46.8％)和不同类型的CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因(53.2％);<br>　　(4)500例21-OHD患者中共检出9种CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因，即CH-1到CH-9，其中最常见的类型为CH-5型(33.7％)、CH-1型(25.0％)和CH-2型(20.6％)。<br>　　结论<br>　　本研究的CYP21A2基因突变谱表明，既往文献报道的最常见的10种CYP21A2基因突变发生率占总突变的92％以上，也是中国21-OHD患者的热点突变位点。首次发现了15种罕见CYP21A2基因致病突变位点，扩大了CYP21A2基因突变谱。首次全面检测了21-OHD患者的CYP21A2基因拷贝数变异。CYP21A2基因拷贝数增加(3拷贝重复)发生率较低(0.4％)，提示3拷贝重复的21-OHD患者需要检出3个等位基因均有突变才可明确诊断。CYP21A2基因拷贝缺失发生率高达34.6％，包括CYP21A2基因大片段缺失及9种不同类型的CYP21A1P/CYP21A2嵌合基因。<br>　　第二部分:CAH-X综合征患者TNXA/TNXB嵌合基因类型和表型的研究<br>　　背景<br>　　CYP21A2基因的拷贝缺失广泛存在于21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)患者中，基因的转换与重排是拷贝缺失的主要原因。CYP21A2及其假基因CYP21A1P与TNXB及其假基因TNXA串联排列于6号染色体人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因座Ⅲ区，由于该区域内高频重组事件的发生，且功能基因和其假基因间的高度同源及相邻排列特点，在减数分裂四分体时期发生的交叉互换可导致TNXA/TNXB嵌合基因的形成。TNXB基因异常所导致的腱糖蛋白X(tenascin，TNX)缺乏与先天性结缔组织异常疾病——埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome，EDS)的临床表现相关。携带TNXA/TNXB嵌合基因的21-OHD患者，由于CYP21A2与TNXB基因的连续性缺陷，CAH和EDS相关的症状同时出现，引起一种新的综合征——CAH-X综合征的发生。目前已报道的CAH-X综合征共分三种类型，即CAH-X综合征1型、2型和3型，患者分别携带三种不同类型的TNXA/TNXB嵌合基因。目前对于CAH-X综合征及TNXA/TNXB嵌合基因的研究尚少，仅有美国的1个研究中心有较为深入的研究报道，关于中国21-OHD患者中CAH-X综合征的患病情况及EDS相关的临床表现未见报道。<br>　　目的<br>　　本研究旨在探究中国21-OHD患者中CAH-X综合征的患病情况及TNXA/TNXB嵌合基因的发生率，并进一步比较携带不同TNXA/TNXB嵌合基因的CAH-X综合征的患者结缔组织相关症状的差异。<br>　　方法<br>　　纳入2015年1月至2019年7月在北京协和医院内分泌科就诊，并经基因检测明确存在CYP21A2基因拷贝缺失变异的21-OHD患者共160例。根据多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)结果判断CYP21A2基因及TNXB基因第35外显子的缺失突变。提取患者外周血白细胞DNA，利用PCR扩增加Sanger测序技术，检测患者TNXB基因第40、41和43外显子的点突变。对2019年7月至12月随诊的125例21-OHD患者进行EDS相关症状的评估，内容包括关节的活动、皮肤伸展情况、消化道及心血管等系统的表现，其中31例携带TNXA/TNXB嵌合基因的患者为病例组，94例无TNXA/TNXB嵌合基因的患者为对照组。<br>　　结果<br>　　(1)160例CYP21A2基因拷贝缺失的21-OHD患者中，59例携带CYP21A2及TNXB基因的联合缺陷。其中，35例患者存在CYP21A2基因至TNXB基因第35外显子的连续缺失，即TNXA/TNXB嵌合基因1型;13例患者存在CYP21A2基因至TNXB基因第40外显子的连续缺失，即TNXA/TNXB嵌合基因2型;11例患者存在CYP21A2基因至TNXB基因第41外显子的连续缺失，即TNXA/TNXB嵌合基因3型。三种CAH-X综合征嵌合基因(CAH-X综合征1型，2型和3型)在CYP21A2基因拷贝数缺失的患者中所占的比例分别为21.9％、8.1％和6.9％;<br>　　(2)对125例患者进行EDS相关症状的评估，结果显示，携带TNXA/TNXB嵌合基因的21-OHD患者发生EDS相关症状的比例比未携带嵌合基因的对照组更高，分别为71.0％(22/31)和26.6％(25/94)，差异有统计学意义(p＜0.001)。其中，关节组织方面，携带嵌合基因的患者发生关节活动过度的比例更高(p＜0.001);皮肤组织方面，携带嵌合基因的患者发生皮肤松弛的比例更高(p＜0.001)，出现天鹅绒样皮肤的比例更高(p=0.015)，伤口愈合延迟的比例更高(p=0.033)。<br>　　(3)CAH-X综合征2型和3型患者关节活动过度的比例明显高于1型患者，分别为60％和20％，差异有统计学意义(p=0.028)。<br>　　结论<br>　　CYP21A2基因拷贝数缺失的21-OHD患者中，约37％携带TNXA/TNXB嵌合基因，可诊断为CAH-X综合征，且多数患者出现EDS相关的临床症状，但也有部分未携带嵌合基因的患者表现出关节或皮肤异常。对于CAH-X综合征患者基因型与临床表型的关系仍需要进一步的研究。