检索历史 清除

摘要目的:<br>　　探讨钟基因nr1d1在BPA暴露导致焦虑样行为中的作用及可能的机制。<br>　　方法:<br>　　1、转录组测序及生物信息学分析<br>　　将斑马鱼鱼卵暴露于25μmol/L BPA溶液中至72hpf(hour post fertilization,hpf)随后换系统水培养到96hpf并收集幼鱼样本，采用转录组测序技术(RNA-sequencing,RNA-seq)检测斑马鱼体内基因转录变化，并对差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)进行GO(Gene Ontology)和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，筛选出昼夜节律相关的差异基因，并通过实时荧光定量PCR对差异基因进行验证，确定发挥关键作用的钟基因。<br>　　2、斑马鱼趋触性实验<br>　　将斑马鱼鱼卵暴露于不同处理条件至72hpf后，用系统水培养至120hpf分别进行趋触性实验，在连续光照条件及光暗交替条件下评估不同处理组斑马鱼幼鱼趋触性行为的改变。<br>　　3、斑马鱼节律相关指标的检测<br>　　将斑马鱼鱼卵暴露于不同处理条件至72hpf,用系统水培养至96hpf，在持续黑暗下条件检测5天，使用Etho VisionXT10.0软件记录并分析斑马鱼的运动距离，使用BioDare2网站分析斑马鱼的振幅、周期和相位。运用实时荧光定量PCR检测不同处理组斑马鱼钟基因(nr1d1、bmalla和nfil3的转录水平变化。<br>　　4、多巴胺系统相关指标检测<br>　　将斑马鱼鱼卵暴露于不同处理条件至72hpf,用系统水培养至96hpf,运用实时荧光定量PCR检测多巴胺合成代谢过程中的关键基因(nr4a2a、th、ddc,dbh)转录水平;运用液相色谱串联质谱检测不同处理组斑马鱼体内神经递质（多巴、多巴胺、去甲肾上腺素）的含量。<br>　　5、炎症相关指标检测<br>　　将斑马鱼鱼卵暴露于不同处理条件至72hpf，用系统水培养至96hpf，运用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)和白细胞介素6(il-6)的转录水平;用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6)含量;运用Tg(lyz:EGFP)转基因斑马鱼观察中性粒细胞迁移情况。<br>　　6、星形胶质细胞功能检测<br>　　将转基因斑马鱼Tg(gfap:EGFP)鱼卵暴露于不同处理条件至72hpf,用系统水培养至96hpf，测定不同处理组对星形胶质细胞功能的影响，使用Image J软件对荧光强度其进行半定量分析。<br>　　结果:<br>　　1、转录组学分析显示25μmol/L BPA暴露后有8366个DEGs，其中3444个DEGs上调，4922个DEGs下调，对差异基因进行GO及KEGG分析，发现BPA暴露影响昼夜节律调节、多巴胺能神经元分化和炎症反应相关基因。<br>　　2、在趋触性实验中，连续光照和光暗交替条件下，25μmol/LBPA组斑马鱼趋触性显著高于对照组，nr1d1激动剂GSK4112可以恢复BPA所致的趋触性升高的现象。<br>　　3、斑马鱼节律变化:在自发运动节律实验中，25μmol/L BPA组斑马鱼自发运动节律发生改变，表现为振幅较对照组下降36.78％;定量PCR结果发现BPA可导致钟基因nr1d1显著下调，其下游靶基因bmalla和nfil3显著上调。nr1d1激动剂GSK4112可以恢复由BPA引起的自发运动节律紊乱和钟基因转录水平的失调。<br>　　4、斑马鱼多巴胺系统变化:定量PCR结果发现25μmol/LBPA导致nr4a2a、th和dbh转录水平显著升高，ddc转录水平显著下降;液相色谱串联质谱检测结果发现BPA引起斑马鱼体内神经递质多巴和去甲肾上腺素显著含量上升、多巴胺含量显著下降。nr1d1激动剂GSK4112可以恢复由BPA引起的多巴胺系统失调。<br>　　5、炎症反应的变化:荧光定量PCR和ELISA结果发现25μmol/LBPA可显著升高肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6的转录水平及蛋白水平;使转基因斑马鱼Tg(lyz:EGFP)中性粒细胞向头部募集。nr1d1激动剂GSK4112可以恢复由BPA引起的炎症反应的发生。<br>　　6、星形胶质细胞功能:25μmol/LBPA暴露显著增强转基因斑马鱼Tg(gfap:EGFP)的荧光强度。nr1d1激动剂GSK4112可以恢复由BPA引起的星形胶质细胞的激活。<br>　　结论:<br>　　本实验通过对斑马鱼胚胎期进行BPA暴露，发现BPA会导致斑马鱼幼鱼焦虑样行为，其机制可能是BPA抑制钟基因nr1d1对炎症因子il-6和il-1β的负调控，增加炎症因子il-6、il-1β的转录水平，激活星形胶质细胞，进一步诱导大脑炎症反应的发生，引起多巴胺系统紊乱，最终导致斑马鱼幼鱼出现焦虑样行为。