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摘要心脑血管系统疾病已经成为威胁人类健康的重要杀手，其中急性心肌梗塞位于一些西方发达国家死亡疾病之首。血栓形成是该类疾病的一个重要诱因，溶栓疗法是其治疗的最主要手段。在溶栓治疗过程中，为防止溶栓后再栓塞的发生，溶栓和抗凝药物联合应用是临床治疗血栓相关性疾病的重要给药方案，而出血倾向是血栓治疗的主要副作用。 水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂，是一种新型的抗凝和抗栓药物，但体内半衰期较短。为延长其半衰期，我们利用聚乙二醇对其进行化学修饰。通过改变化学反应中聚乙二醇与水蛭素的比例以及反应体系的pH，获得了不同修饰度的产物。质谱法、SDS-PAGE和HPLC方法分析结果表明修饰产物是不同修饰度水蛭素的混合物。TH发色底物法分析了聚乙二醇修饰前、后水蛭素的活性，结果显示当聚乙二醇与水蛭素摩尔比超过3：1时，水蛭素被修饰后抗凝活性明显下降。用凝胶过滤层析对水蛭素的聚乙二醇修饰产物进行了分离纯化，得到了3个不同修饰度的产物。活性分析表明，连接1个或2个聚乙二醇分子的水蛭素保持了原有活性，而连接3个以上聚乙二醇的水蛭素活性明显降低。动物血浆APTT测定结果表明连接1个和2个聚乙二醇分子的水蛭素可不同程度地延长体内半衰期。因此，我们通过控制聚乙二醇对水蛭素的修饰反应条件，得到了活性保持良好、半衰期延长的聚乙二醇修饰的水蛭素产品，使其有可能成为一种新的抗凝药物的缓释剂。 组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和葡激酶(SAK)对血栓都具有一定的选择性，因而是目前被认为溶栓效果较好、副作用较小的两种溶栓药物。为进一步提高t-PA和SAK对血栓的选择性、提高溶栓效率、降低其临床用药量，同时，降低HV在非血栓部位的浓度或活性从而减小出血的危险，我们利用HV的C-末端对凝血酶的高亲和性和N-末端延伸引起活性降低的特性，设计并构建了三个融合蛋白：①通过凝血因子FXa识别序列连接的t-PA与HV的融合蛋白(TFXH)；②通过凝血因子FXa识别序列连接的SAK与HV的融合蛋白(SFXH)；③通过凝血酶识别序列连接的SAK与HV的融合蛋白(STH)。目的是期望融合蛋白具有以下特性①溶栓抗凝双重功能；②靶向释放抗凝活性；③减小出血倾向等。 t-PA是血管内皮细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶，含有17对二硫键，而HV分子中有3对二硫键，考虑到翻译后的正确折叠和加工修饰，我们采用酵母表达体系表达融合蛋白TFXH。通过提取ECV304细胞总RNA和RT-PCR的方法获得了tpa基因，5'端含有FXa识别序列(IEGR)对应碱基的HV基因(fxh)通过引物设计和PCR方法产生。tpa基因与fxh基因通过连接酶连入pGEM-T，产生融合蛋白基因tfxh，然后经载体pIC9最终克隆至表达载体pIC9K上。融合蛋白基因tfxh经电转法导入毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。限制性酶切和PCR鉴定结果均表明融合蛋白基因tfxh已克隆入表达载体和宿主菌。通过甲醇利用实验、G418抗性筛选实验获得了多拷贝甲醇迅速利用型克隆。转化子用甲醇进行诱导表达，摇瓶内表达产物TFXH以单链和双链两种形式存在，而在发酵罐中，随着发酵时间的延长，TFXH单链形式减少，主要以双链形式存在。采用纤维蛋白平板溶圈法和纤维蛋白凝块法分别检测TFXH的溶栓和抗凝活性。结果表明表达产物TFXH具有溶栓活性并可被抗t-PA抗体抑制，完整的TFXH无抗凝活性，但以FXa裂解后可释放游离水蛭素从而表现出抗凝活性。采用亲和层析的方法对TFXH进行了分离纯化，得到了较纯的TFXH产品。 SAK是由某些金黄色葡萄球菌产生的一种非酶类蛋白，本身无酶活性，在与纤溶酶原1：1结合后能使纤溶酶原活化为有活性的纤溶酶，进而激活更多的纤溶酶原，从而产生溶栓作用。我们采用大肠杆菌表达体系来表达SAK和HV的融合蛋白SFXH和STH，通过体外实验和体内实验研究了SFXH和STH的功能。 融合蛋白SFXH和STH的构建、表达和分离纯化工艺的建立：通过提取金黄色葡萄球菌基因组DNA和PCR的方法获得sak基因，通过引物设计和PCR方法分别获得5'端含有FXa识别序列(IEGR)对应碱基和凝血酶识别序列(LGPR)对应碱基的两种HV基因：fxh和th。两种融合蛋白基因sfxh和sth克隆到表达载体pBV220，转入大肠杆菌后进行温度诱导表达，在发酵过程中考察了种子培养时间和流加营养物对菌生长状态和蛋白表达的影响，结果显示种子放大培养12h为最佳，营养物的流加可增加最终的菌体湿重和蛋白表达量。采用反复冻融提取、凝胶过滤层析和离子交换层析的方法对融合蛋白进行分离纯化，纯化的蛋白回收率和活性回收率分别为20.6％和57.6％。纯化产物经HPLC和SDS-PAGE分析，其纯度达96％以上。SFXH的N-末端测序结果与预期一致，等电点为5.53，相对分子质量为22998.60。 融合蛋白SFXH和STH的功能研究：在体外，SFXH和STH可分别被FXa和凝血酶裂解，均可分别产生游离的SAK和HV。采用纤维蛋白平板溶圈法和发色底物S-2251法检测融合蛋白的纤溶活性，纤维蛋白凝块法检测抗凝活性。结果表明两种融合蛋白SFXH和STH都具有溶栓活性但无抗凝活性，SFXH以FXa裂解后可释放抗凝活性。免疫组化实验结果提示SFXH和STH对血栓具有一定的靶向性，且能溶解血栓中的纤维蛋白。 SFXH和STH的体内功能研究：我们通过角叉菜胶引发的小鼠尾部血栓和大鼠下腔静脉血栓两种不同机制的血栓模型对SFXH和STH的体内溶栓抗凝作用进行了评价：①小鼠尾部血栓模型：通过皮下给予角叉菜胶引发小鼠尾部血栓形成，然后给予各受试药物。实验结果表明SFXH和STH组血栓发生频率和血栓长度都低于生理盐水组和SAK组。②大鼠下腔静脉血栓模型：通过结扎大鼠下腔静脉在下腔静脉内制造血栓，然后给予各受试药物。给药后1h取血栓称湿重，测定结扎前、给药前、给药后30min和给药后1h血浆的TT、APTT和PT值。实验结果表明SFXH和STH组血栓湿重明显低于SAK组和HV组，SFXH组效果与SAK+HV联合用药组相当。SFXH和STH组血浆TT、APTT和PT无明显升高，而HV组和SAK+HV组明显升高。 通过以上实验结果，我们可以得出以下结论：①通过控制PEG对水蛭素的修饰反应条件，得到了活性保持良好、半衰期延长的PEG修饰的水蛭素产品。②通过FXa识别序列连接的t-PA和HV融合基因tfxh成功构建至毕赤酵母GS115中并获得了表达；完整的融合蛋白TFXH在体外具有溶栓活性而无抗凝活性，被FXa裂解后具有抗凝活性，因而具有溶栓和抗凝双功能；③通过FXa识别序列和凝血酶识别序列连接的SAK和HV融合基因sfxh和sth成功构建至大肠杆菌中并获得高效表达；建立了融合蛋白SFXH和STH的生产工艺，工艺简单可行，并可稳定放大；SFXH和STH在体外可分别被FXa和凝血酶裂解，裂解后的SFXH体现出抗凝活性；免疫组化结果显示SFXH和STH对血栓具有一定的靶向性；SFXH和STH在体内的溶栓抗凝效果优于SAK和HV，可在血栓部位靶向释放抗凝活性，且无明显的出血倾向。 因此，PEG修饰的水蛭素产品有可能成为一种新的抗凝药物的缓释剂；而我们构建表达的融合蛋白有望成为一种临床上有效的、出血副作用低的具有靶向溶栓和抗凝双重功能的新型药物。