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摘要草酸青霉菌P8(Penicilliumoxalicum)由中国农科院土肥所菌种保藏中心范丙全从土壤中分离获得。在温室盆栽条件下施用P8能有效溶解土壤中难溶磷，对花生、油菜、玉米等作物都产生明显的促生作用。本试验用GFP(GreenFluorescentProten)和潮霉素抗性的双标记载体标记溶磷菌株草酸青霉菌P8，筛选稳定、高效表达GFP并对潮霉素产生抗性的双标记转化菌株，应用激光共聚焦显微镜原位观察研究其在作物根际的空间分布、繁殖和存活能力。主要研究内容如下： (一)应用基因重组技术，利用真核表达载体pNOM102作为重组质粒的骨架载体，将潮霉素抗性和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因装在强基因表达信号GPD(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子和TtrpC中止子表达框之间，构建了用于标记草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)P8丝状真菌表达载体pHYGEGFP。 (二)对草酸青霉菌P8的原生质体形成和再生条件进行研究。从制备P8孢子悬液开始，对菌龄、破壁酶系统、渗透压稳定剂种类及浓度、酶解时间和温度、再生培养基等影响原生质体形成和再生的主要因素进行了研究，总结出一套高效制备草酸青霉菌原生质体的方法，得出青霉菌P8菌株原生质体形成的最适宜条件是：菌龄18h，25mg/mL的蜗牛酶和纤维素酶混合酶体系，pH为6.0的0.6mol/LNaCl的渗透压稳定剂，酶解2.5～3h，原生质体产量可以达到106～107cfu/mL；用平板稀释法以0.6mol/LNaCl、0.8％琼脂的CM培养基培养原生质体上，再生率最高达60％以上。 (三)质粒DNApHYGEGFP经PEG介导转化青霉菌P8原生质体，筛选出高效、稳定表达潮霉素B抗性和绿色荧光蛋白基因的5株青霉菌转化菌株；转化菌株与野生型菌株P8的形态学特征和生理学特征经微生物学方法分析没有明显差异。青霉菌P8导入外源基因后并不影响其高效溶磷能力。继代转接和Southern杂交分析表明，外源DNA非特异整合到真菌的基因组DNA上，随宿主菌的转代而稳定遗传。 (四)利用激光共聚焦扫描显微镜可观察到土壤中P8-b的绿色菌丝和分生孢子。用激光共聚焦显微镜原位观察青霉菌P8-b在玉米根际的定殖状况，表明P8-b可在玉米生长繁殖并稳定定殖于玉米的根际；青霉菌P8-b在营养物质丰富的种子胚乳表面及根表上部根段定殖较好。 (五)温室条件下研究了不同栽培条件对青霉菌P8-b定殖的影响。青霉菌P8-b在玉米、大豆、棉花、小麦、花生不同类型作物根际都能生存定殖。根际定殖数量最高达105～106cfu/g土，玉米根际定殖数量最多，棉花根际定殖的P8-b数量最少。研究还表明，青霉菌P8-b在作物根际定殖数量高于非根际土；随着初始接种量的增加，菌体在作物根际的定殖能力增强。青霉菌P8-b在黑土、潮土、红壤三种土壤中的定殖能力依次减弱。在玉米生长至35d时，青霉菌P8-b在玉米根际定殖能数量分别为黑土9.86×105cfu/g土、潮土6.81×105cfu/g土、红壤0.86×105cfu/g土。