检索历史 清除

摘要Orexin是1998年发现的一种肽类物质，参与动物体内采食量的调控，具有促进动物摄食的功能。有鉴于此，本研究旨在利用orexin对动物的促采食功能，通过基因工程和分子生物学实验技术，构建了pcDNA3．1(+)一OrexinA真核表达质粒，并且研究了该表达质粒在猪骨骼肌卫星细胞中mRNA水平的表达，为下一步工作展开，即真核表达质粒pcDNA3．1(+)一Orexina在猪肌肉组织中的注射及其表达产物对猪促生长效应的研究做前期理论探讨。 本研究由三个试验组成：(1)重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA的构建：人工合成orexinA片断，利用酶切、连接等分子生物学实验技术将orexinA片断克隆到真核表达质粒pcDNA3．1(+)的多克隆位点上。(2)猪的骨骼肌细胞原代培养及重组质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA转染骨骼肌细胞：采用0．1％胶原酶II24小时消化法消化猪骨骼肌细胞，利用差速贴壁法获得纯度较高的骨骼肌卫星细胞，待细胞长满90％，就用裸质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA及质粒一脂质体复合物转染猪骨骼肌卫星细胞，同时在试验中还设有空白对照组及pcDNA3．1(+)质粒转染组作为试验对照。(3)重组质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA在骨骼肌细胞中mRNA表达水平的检测：转染48h后，将各组细胞以每孔为单位收集，抽提总RNA，反转录，PCR鉴定各组有无orexinA基因在骨骼肌卫星细胞中表达，并用实时荧光定量PCR法进一步比较裸质粒转染组与质粒一脂质体复合物转染组orexinAmRNA的表达效率。 试验结果表明：(1)人工合成的带有酶切位点及信号肽序列的orexinA片断序列正确，通过酶切连接克隆到真核表达质粒pcDNA3．1(+)的多克隆位点上，重组质粒经PCR、酶切、测序表明构建成功且序列正确。(2)采用O．1％胶原酶II24小时消化法分离猪骨骼肌细胞，并用差速贴壁法获得了高纯度，高活率的骨骼肌卫星细胞。(3)用RT一PCR法对重组质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA在猪骨骼肌细胞中mRNA表达水平进行检测，结果表明，空白对照组，pcDNA3．1(+)质粒转染组的PCR产物中没有检测到orexinA基因mRNA的表达，而在裸质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA转染组，质粒一脂质体复合物转染组中，均检测到有orexinA基因mRNA的表达。(4)用荧光定量PCR法比较裸质粒转染组与质粒一脂质体复合物转染组的表达效率，发现转染48h后质粒一脂质体复合物转染组的转染效率显著高于裸质粒转染组(P<O．05)。 上述结果提示，本试验成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA，并用该质粒转染猪骨骼肌卫星细胞，用RT-PCR法检测到该质粒在骨骼肌卫星细胞中有表达，该结果为真核表达质粒pcDNA3．1(+)一OrexinA在猪肌肉组织中的注射及其表达产物对猪促生长效应的研究提供了理论支持。