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摘要环孢素A(CyclosporinA，CsA)自20世纪70年代应用于临床以来，作为免疫抑制剂发挥了极其重要的作用：是目前公认的抑制移植后排斥反应最为有效的药物之一。CsA是一种具有亲脂性的环状多肽化合物，该药能通过竞争性地与细胞浆内的环孢亲和素(Cyclophilin)结合蛋白结合，从而显示T淋巴细胞的抑制效应，阻断参与排斥反应的体液和细胞效应机制，防止排斥反应的发生。而且其对某些自身免疫性疾病的治疗亦已取得一定的疗效。 正常生理妊娠类似于同种异体移植，胚胎作为自然的同种移植物不受母体免疫排斥是免疫排斥现象的唯一例外，实际上反映了母体对胚胎的免疫耐受。而妊娠失败多因母体对胚胎的免疫排斥所致。我们前期研究发现，于孕早期(胚胎着床期)腹腔注射CsA，可恢复小鼠妊娠失败模型母一胎界面Thl／Th2／Th3型细胞因子转录水平免疫调节的生理平衡，形成维持正常妊娠所需的Th2／3型免疫偏倚，并诱导外周免疫细胞对父系抗原的免疫耐受，使流产模型的妊娠预后达到正常妊娠水平[2]；体外实验证实CsA可刺激人早孕期滋养细胞生长，并改变其细胞形态，使其迁移能力及侵袭性增强口】。显然CsA在一定浓度范围内对母胎界面具有良好的调节作用。 本研究通过CsA作用于自然流产模型孕鼠，研究其对小鼠自然流产模型妊娠结局的影响及其对母胎界面及外周的免疫耐受的诱导，并进一步解析其分子机制，为反复自然流产等妊娠疾患的治疗提供新线索。 第一部分 环孢素A对小鼠自然流产模型妊娠结局及母胎界面协同刺激分子表达的影响 目的：探讨环孢素A对小鼠自然流产模型妊娠预后及母胎界面协同刺激分子表达的影响。 方法：将雌性CBA／J小鼠分别与雄性DBA／2小鼠和雄性BALB／c小鼠以2：1合笼交配建立小鼠自然流产模型和正常妊娠模型[7]，见阴栓日为妊娠第0天。于孕第4天给予CBA／J孕鼠单次灌服环孢素A，按照给药剂量分为四组，分别为0mg／kg组(对照组)，0．1mg／kg组，lmg／kg组，10mg／kg组。正常妊娠模型组未给药。孕14天计数各组CBA／J孕鼠的胚胎吸收率。并采用实时定量RT-PCR方法检测孕鼠第9天及第14天母胎界面协同刺激分子的转录表达水平。 结果：未处理CBA／JxDBA／2孕鼠孕第14天的胚胎吸收率为28．00％，与文献报道20％-30％的自然胚胎吸收率相符。而环孢素A处理组的小鼠胚胎吸收率分别为14．00％(0．1mg／kg)，10．47％(1mg／kg)，15．30％(10mg／kg)。与自然流产模型组相比，用0．1mg／kg，lmg／kg，10mg／kg环孢素A处理组的胚胎吸收率显著下降(P<O．05,P<O．01,P<O．05)。 正常妊娠模型小鼠孕第9天和第14天母胎界面的CD80的表达水平在孕第9天和第14天与自然流产模型孕鼠相比较的比值分别为的0．5396~0．2765和0．0123~0．0098；CD86为0．0656~0．0309和0．0068~0．0008；均低于自然流产模型孕鼠。其配体CD28的表达水平与自然流产模型孕鼠相比为0．0110~0．0056和0．0947~0．0147，明显低于自然流产模型孕鼠；而CTLA-4的表达水平则明显高于自然流产模型孕鼠，比值为12．210~2．564和34．0599~6．7963。应用环孢素A后，各组孕鼠母胎界面CD28、CD80、CD86的表达水平与自然流产模型孕鼠相比比值小于1，均有所降低；而CTLA一4的表达水平与自然流产模型孕鼠相比比值大于1，明显升高。 结论：正常妊娠模型孕鼠母胎界面CD28,CD80,CD86的转录水平明显低于自然流产模型孕鼠，CTLA-4的转录水平则高于自然流产模型孕鼠，从而抑制T细胞活化，诱导免疫耐受，进而可影响妊娠结局。环孢素AA可通过调节母胎界面协同刺激信号的表达从而诱导自然流产模型孕鼠对胚胎的免疫耐受从而改善妊娠结局。 第二部分 环孢素A对自然流产模型母胎界面THl／TH2型细胞因子的调节作用 目的：探讨环孢素A(CyclosporinA，CsA)对自然流产模型孕鼠母胎界面Thl／Th2型细胞因子的调控作用。 方法：于孕第9天及第14天分别处死各组CBA／J孕鼠，以ELISA方法检测母胎界面IL-4、IL．10、IFN-~、TNF-a、TGF-β细胞因子的表达水平；并用流式细胞术分析母胎界面滋养细胞分泌IL-10和IFN-y的情况。 结果：胚胎着床期应用CsA后能够显著增加自然流产模型孕第9、14天母一胎界面Th2型细胞因子1L-4、IL-10和TGF-β的表达(P<0．05)；并且能够显著下调自然流产模型孕第9、14天母一胎界面IFN-~和TNF-c~的表达(P<O．05)。 正常妊娠模型组孕早期滋养细胞IL-10的表达水平明显高于自然流产模型组，而IFN-~的表达水平明显低于自然流产模型组；应用CsA后可上调自然流产模型组小鼠孕早期滋养细胞的IL．10水平，并下调IFN-~的表达水平。 结论：孕第4天给予CsA可使自然流产模型孕鼠母．胎界面有利于妊娠维持的Th2型细胞因子(IL-4、IL．10、TGF-β)表达水平升高，同时不利于妊娠维持的Thl型细胞因子(TNF-tx、IFNw)表达水平降低，母一胎界面局部趋向Th2型偏倚。从而诱导母一胎免疫耐受，使流产模型的妊娠预后达到正常妊娠水平。 第三部分 环孢素A对自然流产模型孕鼠外周调节性T细胞亚群的调节 目的：探讨CsA对自然流产模型孕鼠外周调节性T细胞的调控作用。 方法：流式细胞技术检测孕鼠脾脏CD4+CD25+T细胞比例及孕鼠脾脏CD4+CD25+FOXp3+T细胞比例。 结果：(1)自然流产模型CBAJJ孕鼠孕第14天脾细胞CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例为9．21％；而环孢素A处理组的CBA／J孕鼠脾细胞CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例分别为14．23％(O．1mg／kg)，15．10％(1me／kg)，14．18％(10mg／kg)，与自然流产模型(对照组)相比较，各组均显著增高(P<0．05)。(2)正常妊娠模型CBA／J孕鼠孕第9天脾细胞CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例为14．23％；自然流产妊娠模型CBA／J孕鼠孕第9天脾细胞CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD矿T细胞的比例为7．91％；环孢素Almg／kg处理组的CBA／J孕鼠孕第9天脾细胞CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例为13．82％。与自然流产模型相比较，均显著增高(P<0．05)。 结论：(D正常妊娠模型的CBA／J孕鼠孕第9天脾细胞CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例高于自然流产模型孕鼠。(2)孕早期服用CsA可通过提高外周CD4+CD25+调节性T细胞比例，从而诱导母胎免疫耐受，降低自然流产模型的胚胎吸收率。 第四部分 环孢素A对自然流产模型早孕期细胞滋养细胞生物学功能的影响 目的：探讨环孢素A(CyclosporinA，CsA)对早孕期自然流产模型孕鼠细胞滋养细胞生物学功能的调控作用。 方法：应用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度离心法，分离纯化早孕期小鼠细胞滋养细胞，经免疫细胞化学和流式细胞术鉴定其纯度；MTT比色法分析CsA对滋养细胞活力的影响；FCM分析应用CsA后细胞滋养细胞PCNA表达的变化；AnnexinV-FITC／PI双标记流式细胞术分析CsA对细胞早期凋亡的影响；采用transwell法分析小鼠细胞滋养细胞侵袭能力的改变； 结果：(1)行免疫细胞化学鉴定抗cytokeratin7阳性、vimentin单克隆抗体阴性的滋养细胞纯度达95％以上。(2)正常妊娠模型小鼠早孕期细胞滋养细胞的增殖活力及PCNA的表达明显比自然流产模型小鼠强，而在着床期给予CsA处理后，自然流产模型的小鼠早孕期细胞滋养细胞的增殖活力和PCNA表达明显增强，接近正常妊娠模型小鼠早孕期细胞滋养细胞的增殖活力。(3)正常妊娠模型小鼠早孕期细胞滋养细胞早期凋亡率大约为9．54％，自然流产模型小鼠AnnexinV-FITC+、PI一的比率(即早期凋亡率)为14．5％，提示正常妊娠模型小鼠早期凋亡细胞明显比自然流产模型小鼠低，而在着床期给予CsA处理后，自然流产模型的小鼠早孕期细胞滋养细胞凋亡率明显降低为9．1％，接近正常妊娠模型小鼠早孕期细胞滋养细胞的表达水平。(4)正常妊娠模型小鼠早孕期细胞滋养细胞穿入下表面的细胞数明显比自然流产模型小鼠多，而在着床期给予CsAlmg／kg处理后，自然流产模型的小鼠早孕期细胞滋养细胞穿入下表面的细胞数增多，说明其侵袭能力增强。 结论：(1)着床期应用CsA可抑制自然流产模型组小鼠细胞滋养细胞的早期凋亡及促进其增殖。推测CsA对滋养细胞增殖与凋亡的平衡具有重要的调节作用。(2)CsA可有效促进自然流产模型组小鼠早孕期细胞滋养细胞的侵袭能力。从而有利于胚胎着床，胎盘形成，使孕鼠胚胎吸收率降低。