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人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因原核表达及活性鉴定

Cloning, prokaryotic expression and activity identification of human soluble tumor necrosis factor receptor 1 gene in Escherichia Coli JM109

摘要:

目的:构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的原核表达质粒,诱导sTNFR1-MBP融合蛋白表达,观察表达产物的生物学活性.方法:以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1,以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行序列分析和Western blot鉴定.MTT法测定重组蛋白的生物学活性的测定.结果:经DNA序列分析和Western blot鉴定,成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌;在IPTG的诱导下,重组质粒菌能表达sTNFR1-MBP融合蛋白,SDS-PAGE显示在66 kDa处有一特异性表达条带;纯化的sTNFR1-MBP融合蛋白经Western blot证实具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示可有效地封闭TNF-α对QSG7701的细胞毒性作用,随着重组蛋白浓度的增高(0.2,2,20,40,80 mg/L),对TNF-α细胞毒效应的抑制作用增强,细胞死亡率依次为69.98%±1.52%,60.05%±2.18%,46.27%±2.48%,37.02%±3.17%,1.83%±0.59%,1.71%±0.61%.结论:成功获得了具有生物学活性的人sTNFR1-MBP融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.

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作者: 傅蕾 [1] 彭仕芳 [1] 谭德明 [1] 刘洪波 [1]
分类号: R3
栏目名称: 基础研究
DOI: 10.3969/j.issn.1009-3079.2007.13.007
发布时间: 2007-07-30
基金项目:
湖南省自然科学基金
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